منابع تحقیق درباره TAE، TBE، ?CaCl?_2، g

حاوی ناقل اضافه شد.
۹) ستون به مدت ۲ دقیقه در دور rpm10000 سانتریفوژ شد و مایع زیرین دور ریخته شد.
۱۰) در این مرحله ستون با شرایط مرحله ۹ بدون اضافه کردن هیچ محلولی به منظور خشک شدن کامل ستون سانتریفوژ شد.
۱۱) ستون به یک ویال جدید انتقال داده شد.
۱۲) lµ۵۰ Elution Buffer به منظور جدا کردن DNA ناقلی از روی ستون به به مرکز ستون اضافه گردید و به مدت ۲ دقیقه در دمای محیط قرار داده شد.
۱۳) ستون به مدت ۲ دقیقه در دور rpm13000 سانتریفوژ شد و محلول زیر ستون که حاوی ناقل می باشد جمع آوری شد.
۱۴) مراحل ۱۳ و ۱۴ تکرار شد و ناقل در دمای C?20? نگهداری شد.
۲-۱۲- الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز
۲-۱۲-۱- مواد لازم جهت الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز
۲-۱۲-۱-۱- بافر TAE
بافر TAE دارای قدرت تفکیک مناسب برای جداسازی قطعات حدود ۱۰kb بوده و استفاده از آن برای استخراج محصولاتی که برای همسانه سازی و هضم آنزیمی مورد استفاده قرار می گیرند توصیه میشود.بررسی ها نشان می دهد. که یون های موجود در اسید بوریک استفاده شده در ساخت بافر TBE ممکن است برخی از آنزیم های مورد استفاده در مراحل بعدی را غیر فعال نماید، بنابراین در این موارد از بافر TAE استفاده می شود.
مواد لازم برای ساخت بافر TAE در جدول ۲.۹ آورده شده است.
جدول ۲.۹. مواد لازم برای ساخت ۱Lit بافر TAE10X
نوع ترکیب
مقدار
Tris base
۴۸/۸ g
Glacial acetic acid
۱۱/۴۲ ml
(۰.۵ M, pH=8) EDTA
۲۰ ml
dH_2O
تا حجم یک لیتر
بافر باید در دمای اتاق نگهداری شود. جهت تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز از بافر ۱X استفاده می شود. لذا بافر فوق باید به میزان ۱ به ۱۰ رقیق شود.
pH این بافر باید روی ۸ تنظیم شود(Stellwagen et al. 1997).
۲-۱۲-۱-۲- بافر TBE
قدرت یونی و همچنین سرعت الکتروفورز این بافر از TAE بیشتر است. بافر معمول جهت انجام الکتروفورز بافر TBE است.مواد لازم برای ساخت بافر TBE در جدول ۲.۱۰ آورده شده است.
جدول۲.۱۰ . مواد لازم برای ساخت یک لیتر بافر TBE10X
نوع ترکیب
مقدار
Tris base
g108
Boric acid
g5
(۰.۵ M, pH=8) EDTA
ml40
dH_2O
تا حجم یک لیتر
بافر باید در دمای اتاق نگهداری شود. جهت تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز از بافر ۱X استفاده می شود. لذا بافر فوق باید به میزان ۱ به ۱۰ رقیق شود.
به دلیل این که DNA دارای بار منفی است، pH بافر باید در حد خنثی باشد. در صورتی که pH بافر اسیدی یا قلیایی باشد، بار DNA تغییر کرده و حرکت آن در خلال الکتروفورز دچار مشکل می شود( Stellwagen et al. 1997).
۲-۱۲-۱-۳-تهیه ژل آگارز
ژل آگارز از حل نمودن پودر آگارز در بافر مورد نیاز TAE) ویا (TBE تهیه می شود. غلظت آگارز نسبت به بافر به صورت درصد وزنی-حجمی بیان شده و بسته به اندازه قطعات DNA غلظت آگارز متفاوتی استفاده می گردد. ژل های آگارز معمولا در محدوده ۵/۰ تا ۳ درصد ساخته می شوند. ژل هایی با درصد وزنی حجمی ۱ برای جداسازی قطعات بزرگ با طول ۱۰-۳ کیلوباز و ژل هایی با درصد ۲ برای جداسازی قطعاتی با اندازه ۱-۱/۰ کیلوباز به کار می روند. دراین پژوهش از ژل آگارز ۵/۱ درصد برای محصولات PCR و ژل ۱% برای ناقل ها استفاده شد.
۱) قبل از تهیه ژل، سینی ژل آماده و در سطح صافی قرار داده شد.
۲) برای تهیه ژل ۱ درصد ۲/۰ گرم پودر آگارز به ۲۰ml بافر TAE1X اضافه شد.
۳) پس از حل شدن کامل و بعد از این که کمی سرد شد، ۱?l سایبر گرین به آن اضافه شد. در این مرحله محلول را به خوبی مخلوط کرده تا کاملا یکنواخت گردد و سریعا ژل آماده شده درون سینی که از قبل شانه ها در آن قرار داده شده بود، ریخته شد (Johansson et al. 1972).
۴) پس از بسته شدن ژل به طور کامل شانه خارج گردید و پس از آن مقدار کافی بافر TAE1X درون تانک ریخته شده و ژل درون تانک قرار داده شد.
۵) به طور معمول حدود ?l1از نشانگر DNA که از قبل آماده شده بود در چاهک اول ریخته شده و مقدار مناسب از هر نمونه پس از مخلوط شدن باµl2-1 از بافر بارگذاری رنگی (۶X) به ترتیب در چاهک های بعدی قرار داده شد.
۶) پس از بارگذاری نمونه ها، درب تانک بسته شده و بسته به اندازه نمونه و حساسیت تفکیک مورد نظر با ولتاژ ۵۰ یا ۱۰۰ ولت انجام می شود. پس از اتمام الکتروفورز ژل توسط دستگاه ژل داکیومنتیشن مشاهده گردید و وضعیت باندهای DNA مورد نظر بررسی شد.
معمولا در زمان مقایسه بین هضم های آنزیمی از ولتاژ پایین تر استفاده می شود تا میزان تفکیک بهتر شود.
۲-۱۲-۱-۴- نشانگر اندازه DNA
نشانگرهای اندازه DNA، شامل توالی های DNA با طول مشخصی هستند که پس از بارگذاری بر روی ژل به ترتیب اندازه شان از یکدیگر دور می شوند و به صورت تجاری موجود هستند. برای تولید نشانگرها معمولا از DNA ویروس هایی نظیر فاژلامبدا استفاده شده و DNA مورد نظر با استفاده از آنزیم های محدود کننده ویژه ای برش داده می شوند. انواع مختلفی از این نشانگرها موجود است که با توجه به طول DNA مورد بررسی، انتخاب و استفاده می شوند. در این پژوهش از نشانگر شرکت فرمنتاز، Gene Ruler^TM100 bp DNA ladder استفاده شد.
شکل۲.۴.اندازه نمای DNA، Gene Ruler^TM100 bp DNA ladderشرکت فرمنتاز.
برای استفاده از نشانگر شرکت فرمنتاز ?l1 از این نشانگر با ?l1 بافر بارگذاری X6و ?l4 آب مقطر مخلوط و ?l1از آن روی ژل بارگذاری شد.
۲-۱۲-۱-۵-رنگ سایبر گرین
برای رنگ آمیزی DNA از سایبر گرین استفاده شد.این رنگ از جمله رنگ های درخشانی است که با ملکول های دو رشته ای DNA پیوند بسیار اختصاصی برقرار میکند.میزان جهش زایی آن از اتیدیوم بروماید بسیار کمتر بوده و در عین حال دفع ترکیبات آغشته به آن فاقد مشکلات مربوط به اتیدیوم بروماید است.سایبر گرین استفاده شد از شرکت سیناژن بوده، میزان رنگ سایبر گرین در ژل آگارز ۰۳.۰ در میلی لیتر بوده بنابراین به ۱۰۰ میلی لیتر ژل ۳ میکرولیتر سایبر گرین از محلول استوک میزنیم.رنگ در بسته بندی تیره بوده و در یخچال نگهداری می شود.
۲-۱۲-۱-۶- بافر بارگذاری
بافر بارگذاری به منظور تسهیل قرار گیری DNA در چاهک های ژل آگارز و نیز ردیابی حرکت DNA بر روی ژل، استفاده می شود. بافر مذکور به دلیل دارا بودن گلیسرول، ویسکوزیته ی بالایی داشته و سبب قرار گیری نمونه ها در ته چاهک میگردد. این بافر از دو رنگ بروموفنول بلو (با حرکت سریع تر) و زایلن سیانول (با حرکت آهسته تر) تشکیل شده است. ترکیب بافر بارگذاری ۶X درجدول ۲.۱۱ آورده شده است.
جدول ۲.۱۱. ترکیب بافر بارگذاری ۶X
نوع ترکیب
مقدار
Bromophnol Blue
g 25/0%
Xylen Cyanol
g 25/0%
Glycerol
g 30/0%
(pH=8) EDTA
mM60
(pH=7.6) Tris-HCI
mM10
۲-۱۲-۲- تعیین اندازه و غلظت DNA توسط الکتروفورز
برای تعیین اندازه و غلظت DNA توسط الکترو فورز از نشانگر اندازه ی DNA استفاده می شود. غلظت هر باند نشانگر از قبل توسط شرکت سازنده ی آن مشخص شده است. بنابراین می توان با مقایسه غلظت باند نشانگر و باندی که از بارگذاری نمونه DNA مشاهده می گردد، غلظت قطعه ی مورد نظر را تخمین زد.
۲-۱۲-۳- تخمین غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر
برای تعیین غلظت DNA ناقلی، جذب آن در طول موج ۲۶۰ nm توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. همچنین به منظور بررسی کیفیت و خلوص DNA استخراج شده نسبت جذب ۲۶۰ به ۲۸۰ نیز بررسی شد. اگر این نسبت در حدود ۸/۱ باشد DNA تقریبا خالص است، اگر کمتر از ۸/۱ باشد مقداری آلودگی پروتئین و مواد آروماتیک مانند فنل در نمونه وجود دارد و اگر بالاتر از ۲ باشد، آلودگی RNA وجود دارد. برای تخمین غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر ابتدا دستگاه با ?l50 آب دو بار تقطیر استریل بلانک شد و سپس ?l1 از نمونه ی DNA در ?l49 آب دو بار تقطیر استریل رقیق شده و جذب آن بررسی شد.
۲-۱۳- تهیه سلول های مستعد۱۰ از باکتری اشرشیاکلی با روش شیمیایی
۲-۱۳-۱- مواد لازم
مواد لازم جهت تهیه سلول مستعد از باکتری اشرشیاکلی در جدول ۲.۱۲ خلاصه شده است.
جدول ۲.۱۲. مواد لازم جهت تهیه سلول مستعد
نوع ترکیب
غلظت
?CaCl?_2
M 1/0
?MgCl?_2
M 1/0
?CaCl?_2-Glycerol

LB محیط کشت

محلول ?CaCl?_2 پس از تهیه با استفاده از فیلترmµ۲۲/۰ و محلول ?MgCl?_2 توسط اتوکلاو استریل می شود.
برای تهیه محلول گلیسرول-?CaCl?_2، ۳ میلی لیترگلیسرول ۶۰% را که قبلا توسط اتوکلاو استریل شده است را به ۷ میلی لیتر محلولM 1/0 ?CaCl?_2 که توسط فیلتر استریل شده اضافه می کنیم.
۲-۱۳-۲- تهیه سلول مستعد
۱) سلول باکتری روی پلیت حاوی محیط کشت LB آگار به صورت خطی کشت داده شد.
۲) یک کلنی تک به ml2 محیط LB مایع انتقال داده شد و سپس در شیکرانکوباتور ?۳۷ به مدت یک شب به منظور ایجاد کدورت و غنی شدن تک کلنی جدا شده قرار داده شد.
۳) ml2از محیط فوق به ml20 محیط جدید انتقال داده شد و در شیکرانکوباتور ?۳۷ تا رسیدن به۸/۰-۴/۰ OD600= قرار گرفت.
۴) سلول ها روی یخ به مدت ۳۰ دقیقه سرد شدند و سپس سلول ها در rpm3000 به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ?۴ سانتریفوژ گردید. (از این مرحله به بعد کلیه مراحل در صورت امکان در اتاق سرد و در صورت عدم دسترسی به آن بر روی یخ و در دمای ?۴ انجام می شود.)
۵) رسوب سلولی در دو برابر حجم محیط کشت اولیه در محلول ?MgCl?_2 سرد شده معلق شد و به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ قرار داده شدو سپس سانتریفوژ با شرایط مرحله قبل انجام شد.
۶) رسوب سلولی در یک دوم حجم محیط کشت اولیه در محلول ?CaCl?_2 سرد شده معلق شد و به مدت یک ساعت بر روی یخ قرار داده شدو سپس سانتریفوژ با شرایط مرحله قبل انجام شد.
۷) رسوب سلولی در ml2محلول گلیسرول-?CaCl?_2 به صورت مخلوط آرام بر روی یخ معلق شد.
۸) سلول های مستعد تهیه شده در ویال های استریل با حجم ۲۰۰ میکرولیتر بر روی یخ تقسیم شدند و بلافاصله در فریزر ۷۰- قرار داده شدند( Sambrook and Russell et al.2001,Pope and Kent et al.1996).
۲-۱۴-ترانسفورماسیون با روش شوک گرمایی
برای انجام فرایند ترانسفورماسیون برای غنی تر شدن محیط کشتLB مورد نیاز برای واکنش، میتوان گلوکز زا به محیط اضافه نمود در این صورت گلوکز را به نسبتی اضافه می کنیم که غلظت آن در محیط کشت نهایی mM50 شود. غلظت های مناسب آنتی بیوتیک برای انتخاب سویه ی مقاوم در جدول ۲.۱۳ آورده شده است.
جدول ۲.۱۳. غلظت آنتی بیوتیک برای انتخاب سویه ی مقاوم
آنتی بیوتیک
غلظت محلول ذخیره (mg/ml)
غلظت محصول نهایی (?g/ml)
حلال
آمپی سیلین
۱۰۰
۱۰۰
آب مقطر
کانامایسین
۵۰
۵۰
آب مقطر
آنتی بیوتیک های حل شونده در آب مقطر توسط فیلتر mµ۲۲/۰استریل شدند.
برای غربالگری صحیح پس از فرایند

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید