منابع تحقیق درباره pET26b، Buffer، BpiI، Wash

ترانسفورماسیون، باید آنتی بیوتیک های مورد نیاز برای وکتور مورد استفاده را با غلظت مناسب به محیط کشت جامد نهایی اضافه کرد.
۲-۱۴-۱- روش انجام ترانسفورماسیون
۱) lµ۵-۳ ناقل ( حداقل ۱۰۰ نانوگرم) به ?l200 سلول باکتری مستعد شده بر روی یخ اضافه شد.
۲) سلول ها به مدت ۳۰-۲۰ دقیقه روی یخ قرار داده شدند.
۳) به منظور القاء شوک حرارتی سلول ها به مدت ۱۲۰-۹۰ ثانیه در ?۴۲ قرار داده شدند.
۴) مجددا ویال به مدت ۱۰ دقیقه روی یخ گذاشته شد.
۵) ?l400 محیط کشت LB به سلول ها اضافه شد و سپس به مدت ۵/۱-۱ ساعت در شیکرانکوباتور ?۳۷ در rpm100 قرار داده شد.
۶) سلول ها در rpm8000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ شدند.
۷) محیط رویی خارج شد و مجددا ?l100 محیط LB به سلول ها اضافه شد و پس از یکنواخت کردن روی محیط LB آگار حاوی آنتی بیوتیک مناسب به صورت چمنی کشت داده شد(Sambrook and Russell et al.2001;Pope and Kent et al.1996).
نمایی شماتیک از واکنش ترانسفورماسیون در شکل ۲.۵ آورده شده است. در این پژوهش ناقل pUC57 که حاوی ژن جهش یافته ی nsLTP2 گیاه برنج ایرانی است به سویه ی اشرشیا کلی DH5? به روش شوک گرمایی ترانسفورم شد.
شکل۲.۵.نمایی شماتیک از واکنش ترانسفورماسیون(www.biomol.de).
۲-۱۵- هضم آنزیمی با آنزیم های محدود کننده
۲-۱۵-۱- مواد لازم برای هضم آنزیمی با آنزیم های محدود کننده
ناقل pET26b در جایگاه MCS11 خود دارای جایگاه برش با دو آنزیم محدود کننده NcoIو XhoI می باشد،همچنین در طراحی ژن جهش یافته ی nsLTP2 گیاه برنج ایرانی در دو طرف ژن جایگاه برش آنزیم های محدود کننده ی BpiI و XhoI طراحی شد،لازم به ذکر است که بخشی از توالی ژنی سنتز شده که با آنزیم BpiI برش میخورد با توالی برش خورده توسط آنزیم NcoI در ناقل pET26b مطابقت دارد. به منظور قرار دادن قطعه ns-LTP2 حامل جهش درون این ناقل، ابتدا ناقل pET26b با دو آنزیم محدود کننده ی NcoIو XhoI وناقل pUC57 که ژن سنتز شده در MCS آن قرار دارد با آنزیم های محدود کننده ی BpiI و XhoI ، برش داده شدند. در واکنش های برش با آنزیم های محدود کننده باید به دمای بهینه فعالیت آنها و سایر شرایطی که خاص هر آنزیم است توجه نمود.در این پژوهش برای ناقل های ذکر شده به طور جداگانه واکنش هضم دوگانه با آنزیم های مربوطه مطابق جدول های ۲.۱۴ و ۲.۱۵انجام شد.
جدول۲.۱۴.ترکیبات لازم برای واکنش هضم آنزیمی دوگانه با آنزیم هایXhoI و NcoI برای ناقل pET26b
نوع ترکیب
مقدار (?l)
وکتور pET26b
۱۰
بافر ۱X Tango
۱۰
آنزیمXhoI
۵.۲
آنزیم NcoI
۵.۲
آب تزریقی استریل
۷۵
جدول۲.۱۵.ترکیبات لازم برای واکنش هضم آنزیمی دوگانه با آنزیم هایXhoI و BpiI برای ناقل pUC57 حاوی ژن جهش یافته.
نوع ترکیب
مقدار (?l)
وکتور pUC57
۸
بافر ۱X Green
۱۲
آنزیمXhoI
۵
آنزیم BpiI
۴.۲
آب تزریقی استریل
۶.۹۲
۲-۱۵-۱-۱- آنزیم (Thermo scientific) XhoI
۱. جایگاه شناسایی و برش آنزیم ۵^’…C?TCGAG… 3^’ میباشد.
? ۳?^’…GAGCT?C… 5′
۲. درجه حرارت مناسب برای فعالیت آنزیم ۳۷ درجه سانتی گراد می باشد.
۳. در بافر Tango 1Xفعالیت آنزیمی ۵۰-۲۰درصد دارد و در بافر۱X Green فعالیت آنزیمی ۱۰۰-۵۰ درصد دارد . این آنزیم فعالیت برشی غیر اختصاصی از خود نشان نمی دهد.
۲-۱۵-۱-۲- آنزیم (Thermo Scientific) NcoI
۱.این آنزیم دارای جایگاه برش۵^’…C?CATGG… 3^’ است
? ۳?^’…GGTAC?C… 5^(‘ )
۲. درجه حرارت مناسب برای فعالیت آنزیم ۳۷ درجه سانتی گراد است.
۳.در بافر ۱X Tango فعالیت آنزیمی ۱۰۰درصد دارد.
۲-۱۵-۱-۳ آنزیم BpiI (Thermo Scientific)
۱.این آنزیم دارای جایگاه برش۵^’…GAAGAC (N)2?… 3^(‘ ) است
? ۳?^’…CTTCTG (N)6?…5^(‘ )
۲. درجه حرارت مناسب برای فعالیت آنزیم ۳۷ درجه سانتی گراد است.۰
۳.در بافر۱X Green فعالیت ۱۰۰ درصد دارد.
۲-۱۶- خالص سازی DNA از ژل
پس از انجام واکنش های هضم آنزیمی و بردن نمونه ها بر روی ژل آگارز و اطمینان از صحت و کامل بودن برش ها باید خالص سازی نمونه ها از ژل انجام میگیرد . در صورتی که حجم نمونه ها زیاد باشد باید تعدادی از دندانه های شانه ی الکتروفورز به منظور ایجاد چاهک بزرگتر به یکدیگر متصل شوند.برای انجام الکتروفورز به منظور خالص سازی نمونه ها از ژل حتما از بافر TAE جدید و مصرف نشده برای تانک بافر استفاده شود.
۲-۱۶-۱- مواد لازم برای خالص سازی DNA از ژل
استخراج از ژل به وسیله ی کیت استخراج از ژل بیونیر((Bioneer به شماره کاتالوگ K-3035 انجام شد.
جدول ۲.۱۶. محتویات کیت استخراج DNA از ژل بیونیر
نوع ترکیب
مقدار/تعداد
Gel Extraction Buffer
Ml120
Column Wash Buffer
ml25
Elution Buffer
ml15
Spin Columns
۲۰۰ عدد
پیش از مصرف Wash buffer اتانول %۱۰۰-۹۶ با نسبت خاصی به آن اضافه گردید.
۲۵ ml………………………………………… Wash buffer
۱۰۰ ml……………………………………….. Ethanol 96-100%
۱۲۵ ml……………………………………….. Total volume
۲-۱۶-۲- روش انجام استخراج DNA از ژل
۱) پس از اتمام الکتروفورز، قطعه ژل حاوی DNA مورد نظر با استفاده از یک اسکالپل تمیز و تیز زیر نور UV بریده شد. (در این مرحله باید کمترین میزان ژل بریده شود تا کارایی استخراج افزایش یابد.)
۲) در این مرحله وزن ژل حاوی DNA اندازه گیری شده و سه برابر وزن آن از محلول Gel Extraction Buffer به آن افزوده شد. (برای مثال mg100از ژل حاوی DNA، ?l300 از Gel Extraction Buffer اضافه شد.)
۳) بافر حاوی ژل به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ?۶۰ قرار داده شد و برای حل شدن کامل ژل در بافر ورتکس گردید.
۴) ?l800 محلول مرحله قبل به ستون خالص سازی انتقال داده شد و در rpm13000 به مدت یک دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ و مایع جمع آوری شده در زیر ستون خارج شد.
۵) ?l500 از Wash buffer به ستون اضافه شد و در rpm13000 به مدت یک دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ و مایع جمع آوری شده در زیر ستون خارج شد.
۶) مجددا ستون بدون اضافه کردن هیچ محلولی به منظور خارج کردن کامل Column Wash Buffer در rpm13000 به مدت یک دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ گردید.
۷) ستون به یک ویال جدید منتقل شد و ?l30 از Elution Buffer به مرکز ستون اضافه شد و به مدت ۳-۲ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد و سپس در rpm13000به مدت دو دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ گردید.
۸) مایع حاوی DNA موجود در ویال جمع آوری و در ?۲۰- نگهداری شد.
برای افزایش کارایی تخلیص، می توان Elution buffer یا آب مورد استفاده را ابتدا در دمای ?۳۷ گرم کرد و سپس به ستون اضافه کرد.
ستون را نیز پس از اضافه کردن Elution buffer یا آب در دمای ?۳۷ و بمدت ۲ دقیقه انکوبه کرد.
آب مورد استفاده در مرحله آخر بهتر است دارای ۸ : pH باشد.
در مراحل پاکسازی گاهی برای افزایش کارآمدی آن برای قطعات زیر bp500از ایزوپروپانول استفاده می شود، چنانچه محصول حاصل برای واکنش PCR مورد استفاده قرار گیرد، به دلیل تغییر در کنفورماسیون DNA واکنش PCR ممکن است دچار اختلال شود.
۲-۱۷- تکنیک الحاق۱۲
غلظت و خلوص DNA حاصل از نمونه های هضم آنزیمی ناقل pET26b و همچنین قطعه حاوی جهش ساخته شده بسیار مهم می باشد. برای انجام کاراتر عمل الحاق، برای محاسبه غلظت ناقل و قطعه وارد شونده از پایگاه اینترنتی Ligation calculator استفاده شد.
نسبت مولی قطعه وارد شونده به ناقل می تواند ۱ به ۱، ۳ به ۱ و ۵ به ۱ باشد .
۲-۱۷-۱- مواد لازم برای تکنیک الحاق
آنزیم T4 DNA Ligase Vivantis به همراه بافر آن برای واکنش الحاق استفاده شد.
۲-۱۷-۲- روش انجام تکنیک الحاق
در این پژوهش قطعه ی حاوی جهش در توالی کدکننده ژن Rice-nsLTP2 در ناقل pET26b وارد شد. مقادیر مورد نیاز برای ناقل و قطعه ی مورد نظر طبق فرمول ذکر شده محاسبه گردید و ترکیبات براساس مقادیز آورده شده در جدول ۲.۱۷ با یکدیگر مخلوط شد و به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۲۲ درجه و ۱۶ ساعت در دمای ?۱۶ قرار گرفت.
جدول ۲.۱۷. ترکیبات لازم برای واکنش اتصال با استفاده از ناقل pET26b
نوع ترکیب
مقدار (?l)
ناقل برش خورده
۶
بافر لیگاز ۱۰x
۵.۱
آنزیم T4 DNA Ligase
۱
قطعه nsLTP2
۲
آب مقطر استریل
۵.۴
حجم کل واکنش
۱۵
واکنش خود اتصالی۱۳ ناقل نیز با همان ترکیبات و مقادیر ذکر شده در جدول بالا و بدون وجود قطعه جهش یافته nsLTP2، به عنوان کنترل انجام شد.
پس از انجام واکنش الحاق، محصول واکنش الحاق ناقل در باکتری اشرشیاکلی BL21 ترانسفورم شد.
۲-۱۸- واکنش کلنی PCR
۲-۱۸-۱- روش انجام واکنش کلنی- PCR
در این مرحله به منظور تایید زیر همسانه سازی های انجام شده و انتخاب کلونی که ناقل نوترکیب را پس از انجام ترانسفورماسیون دریافت کرده اند، واکنش کلنی-PCR انجام شد. به این منظور از پرایمرهای F-T7 و R-T7 استفاده شد. واکنش کلنی-PCR مانند PCR معمولی انجام می گیرد. با این تفاوت که در آن به جای DNA، با استفاده از سر تیپ زرد استریل بخشی از کلونی های ترانسفورم شده را برداشته و در ۲۰ میکرولیتر آب PCR حل می کنیم. سپس ۱۵ میکرولیتر از مخلوط حاصل را به ۱ میلی لیتر محیط کشت LB حاوی غلظت مناسب از آنتی بیوتیک کانامایسین تلقیح می کنیم. ۵ میکرولیتر باقی مانده را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۹۵ درجه و پس از آن ویال ها را به مدت ۱۰ دقیقه روی یخ قرار می دهیم، تا سلول باکتری متلاشی شده و DNA آن خارج شود. در نهایت ۲۰ میکرولیتر از مخلوط واکنش PCR به ویال های فوق اضافه می کنیم(Woodman et al. 2008). در این مرحله از پلاسمید pET26b به عنوان کنترل مثبت و از مخلوط واکنش بدون DNA و کلونی به عنوان کنترل منفی استفاده شد. واکنش PCR در حجم ?l25 با مواد و مقادیر آورده شده در جدول ۲.۱۸ و در ۳۰ چرخه بر اساس برنامه آورده شده در جدول ۲.۱۹ انجام شد.بعد از تایید ورود قطعه به ناقل ها، از کلنی های حاوی پلاسمید نوترکیب استخراج صورت گرفت. بدین صورت که محیط کشت حاوی کلنی دارای وکتور pET26bو ژن nsLTP2 جهش یافته را بعد ۵ ساعت رشد کردن در انکوباتور شیکردار به ۹ میلی لیتر محیط کشت حاوی غلظت مناسب کانامایسین منتقل کرده و بعد از ۱۶ ساعت برای استخراج ناقل یا

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید