منابع تحقیق درباره نرم افزار

برساختار پروتئینی حاصل که از طریق نرم افزار Molegro انجام گرفت طراحی و برای سنتز فرستاده شد.سنتزژن مورد نظر توسط شرکت ShineGene چین انجام گرفت . در طراحی توالی nsLTP2 برنج ایرانی ، در ابتدای ژن جایگاه برشی آنزیم BpiI و در قسمت انتهای توالی جایگاه برشی آنزیم XhoI طراحی گردید. توالی جهت همسانه سازی در باکتری E-coli سویه BL21 از طریق سایت J-cut ((www.J.CAT.comبهینه شدو کدون پایان با هدف بیان His tag موجود در وکتور که توالی آن پس از جایگاه برش Xhol در انتهای MCS وکتور است حذف شد (شکل ۲.۱).
BpiI
۵’ggaagacaacATGGCTTCTTGCAACGCTGGTCAGCTGACCGTTTGCGCTGGTGCTATCGCTGGTGGTGCTCGTCCGACCGCTGCTTGCTGCTCTTCTGCTCGTGCTCAGCAGGGTTGCTTCTGCCAGGCTGCTAAAGACCCGCGTTACGGTCGTTACGTTAACTCTCCGAACGCTCGTAAAGCTGTTTCTTCTTGCGGTATCGCTCTGCCGACCTGCCACctcgagccg 3′
XhoI
شکل۲.۱.توالی ژنی طراحی شده ی nsLTP2 برنج ایرانی.
شکل۲.۲.دیاگرام شماتیک نقشه ی ژنتیکی pET26b
شکل ۲.۳.دیاگرام شماتیک نقشه ی ژنتیکی pUC57
۲-۷- شرایط استریل کردن
با توجه به اهمیت استریل بودن تمام شرایط هنگام انجام تحقیقات میکروبیولوژی و همسانه سازی، محیط های کشت، محلول ها و ظروف شیشه ای توسط اتوکلاو در دمای ?۱۲۱و فشار psi15 به مدت ۲۰ دقیقه استریل شدند. در مواقعی که به محیط کشت آنتی بیوتیک دار نیاز بود، پس از استریل کردن محیط کشت، آنتی بیوتیک رقیق شده با فیلتردیسک ?m 2.0استریل و با نسبت هایی که ذکر خواهد شد به محیط کشت اضافه گردید.
۲-۸-محیط کشت لوریا برتانی۸ (LB)
محیط کشت LB یک محیط عمومی برای رشد اشرشیاکلی است. این محیط براساس نسبت های مندرج در جدول ۲.۳ساخته و سپس استریل شد.
جدول ۲.۳. ترکیبات محیط کشت LB
نوع ترکیب
مقدار(g)
Tryptone
۱۰
NaCL
۱۰
Yeast Extract
۵
Agar
۱۵
Distilled water
تا حجم یک لیتر
برای ساخت محیط مایع آگار حذف گردید و در محیط جامد قبل از اضافه کردن آگار pH محیط با NaOH به ۷-۲/۷ رسانده شد.
۲-۹- آنتی بیوتیک
برای ساخت محلول استوک حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین gr 05/0 پودر آنتی بیوتیک در ۱ میلی لیتر آب مقطر حل می شود. اگر به ازای ۱ میلی لیتر از محیط کشت، ۱ میکرو لیتر از این محلول استفاده شود غلظت نهایی µg/ml50 خواهد بود.
برای ساخت محلول استوک آمپی سیلینgr 1/0 پودر آنتی بیوتیک در ۱ میلی لیتر آب حل می شود. اگر به ازای ۱ میلی لیتر از محیط کشت، ۱ میکرو لیتر از این محلول استفاده شود غلظت نهایی µg/ml100 خواهد بود( Sambrook and Russell et al. 2001). پس از تهیه محلول های استوک، توسط فیلتر ( اندازه منافذmµ ۲.۰) استریل و در فریزر نگهداری شدند.
۲-۱۰- شرایط کشت و نگهداری سویه های باکتری اشرشیا کلی
باکتری اشرشیاکلی در محیط های کشت جامد و مایع در دمایC?37 کشت داده می شود. به طور معمول کشت های مایع درون شیکر انکوباتور بین ۱۸-۱۴ ساعت رشد می کنند. به منظور هوادهی و رشد مناسب، حجم محیط کشت LB باید حدود یک پنجم حجم ارلن یا یک سوم حجم فالکون مورد استفاده باشد( Sambrook and Russell et al. 2001).
۲-۱۰-۱- طرز تهیه استوک گلیسرول
یک تک کلنی از محیط کشت جامد تازه را به ۵ میلی لیتر محیط کشت LB مایع انتقال داده و در شیکرانکوباتور ?۳۷به مدت یک شب (۱۶ ساعت) قرار داده شد. سپس به سلول های رشد یافته گلیسرول استریل با غلظت نهایی ۳۰% اضافه کرده، درون ویال های استریل تقسیم و در C?70- نگهداری می شود (Sambrook and Russell et al. 2001).
۲-۱۱- استخراج ناقل
۲-۱۱-۱- استخراج ناقل با روش لیز قلیایی
برای استخراج ناقل از روش لیز قلیایی استفاده شد. در این روش از سه محلول مختلف استفاده می شود که مواد لازم برای ساخت این محلول ها در جدول های ۲.۴، ۲.۵و ۲.۶ آورده شده است.
پس از استخراج در مرحله نهایی می توان DNA را در محلول TE9 یا آب حل کرد. مواد لازم برای ساخت محلول TE در جدول ۲.۴ آورده شده است Sambrook and Russell et al. 2001)).
جدول ۲.۴. مواد لازم برای ساخت محلول I استخراج ناقل
نوع ترکیب
غلظت (Mm)
Glucose
۵۰
(pH=8) Tris-HCI
۲۵
(pH=8) EDTA
۱۰
محلول I پس از تهیه اتوکلاو در دمای C?4 نگهداری شد.
اگر اتوکلاو قندی موجود نباشد، گلوکز را جداگانه فیلتر کرده و سپس به محلول فوق اضافه می کنیم.
جدول ۲.۵. مواد لازم برای ساخت محلول II استخراج ناقل
نوع ترکیب
غلظت
NaOH
۲/۰ نرمال
SDS
۱% (وزنی/حجمی)
محلول II به صورت تازه تهیه و استفاده شد. ( ترکیبات آن تنها در زمان استفاده با یکدیگر مخلوط شدند). این محلول نباید اتوکلاو شود. در دمای اتاق نگهداری شود.
جدول ۲.۶. مواد لازم برای ساخت ml 100محلول III استخراج ناقل
نوع ترکیب
مقدار(ml)
Potassium acetate (5M)
۶۰
Glacial acetic acid
۵/۱۱
dH_2O
۵/۲۸
محلول III در دمای C?4 نگهداری شود و فقط قبل از استفاده روی یخ قرار گیرد.
جدول ۲.۷. مواد لازم برای ساخت محلول TE
نوع ترکیب
غلظت(Mm)
(pH=8) Tris-HCI
۱۰۰
(pH=8) EDTA
۱۰
RNase A
µg/ml200
محلول TE پس از تهیه اتوکلاو و در دمای اتاق نگهداری شود.
برای انجام استخراج ناقل علاوه بر مواد ذکر شده در جداول بالا به ایزوپروپانول و اتانول ۷۰% نیز نیاز داریم.
۲-۱۱-۱-۱- روش انجام استخراج ناقل با روش لیز قلیایی
۱) یک کلنی تک از باکتری به ml10 محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک مناسب انتقال داده شد و سپس به مدت ۱۸-۱۶ ساعت در شیکرانکوباتور C?37 قرار داده شد.
۲) محیط حاوی باکتری رشد یافته در rpm4000، به مدت ۱۰ دقیقه و دمای C?4 سانتریفوژ گردید.
۳) محیط رویی خارج شد و رسوب تا حد امکان خشک گردید.
۴) رسوب سلولی در ?l200 محلول I سرد به وسیله ورتکس حل و محلول حاصل به یک ویال انتقال داده شد.
۵) ?l400 محلول II به هر سوسپانسیون باکتری اضافه شده سپس ویال به منظور مخلوط شدن ده بار سروته گردید و ویال روی یخ قرار داده شد.
در این مرحله و مرحله بعد نباید سوسپانسیون حاصل ورتکس یا پیپت شود.
۶) ?l300 محلول III به هر ویال اضافه شد، ویال چند بار سر و ته شده و سپس ویال به مدت ۵-۳ دقیقه روی یخ قرار داده شد.
مطالعات و آزمایش های مکرر نشان داد که برای وکتورهای با تعداد کپی کم در باکتری بهتر است از ?l700 محلول III استفاده شود، تا کارایی استخراج ناقل بهتر شود.
۷) ویال در rpm13000 به مدت ۱۰ دقیقه و دمایC?4 سانتریفوژ و محلول شفاف رویی به یک ویال جدید انتقال داده شد.
دقت شود که محلول رویی طوری برداشته شود که رسوب سلولی همراه آن نباشد.
۸) به منظور رسوب دادن DNA ناقلی، هم حجم با محلول به آن ایزوپروپانول اضافه و به صورت آرام ورتکس شد و سپس به مدت ۲ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت.
۹) ویال در rpm13000، به مدت ۶ دقیقه و دمای اتاق سانتریفوژ شد.
۱۰) محیط رویی خارج و رسوب تا حد امکان خشک گردید.
ویال روی دستمال کاغذی وارونه شد تا قطره هایی که به دیواره چسبیده اند نیز خارج شوند.
۱۱) ml 1اتانول ۷۰% به رسوب اضافه شد و سپس ویال در rpm13000، به مدت ۲ دقیقه و دمای اتاق سانتریفوژ گردید.
۱۲) محیط رویی خارج و رسوب به طور کامل خشک شد (ویال به مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار داده شد تا تمام اتانول تبخیر شود).
در این مرحله رسوب به راحتی از ویال جدا می شود، لذا در حین خارج کردن محیط رویی دقت شود که رسوب همراه با محیط رویی دور ریخته نشود.
۱۳) ناقل حاصل در ?l100 بافر TE حل شد، سپس به آرامی پیپتاژ شده و درC?20? نگهداری شد.
در این مرحله می توان به جای بافر TE، ناقل را در آب مقطر استریل حل کرد. مخصوصا زمانی که ناقل برای انجام تعیین توالی و یا واکنش های هضم آنزیمی آماده می شود آب حلال بسیار مناسبتری برای ناقل است.
۲-۱۱-۲- استخراج ناقل با استفاده از کیت شرکت بیو بیسیک
محتویات کیت استخراج ناقل بیوبیسیک به شماره کاتالوگ BS413 در جدول ۲.۸ آورده شده است.
جدول ۲.۸.محتویات کیت استخراج ناقل بیوبیسیک
نوع ترکیب
مقدار/تعداد
Solution I (SI)
Ml6
Solution (SII)
Ml12
Neutralizing Buffer (Buffer NB)
ml25
Wash solution
Ml20
RNase A (DNase-free)
?l120
Elution buffer
ml5
Spin columns
۵۰ عدد
برای استخراج ناقل با استفاده از کیت، یک کلنی تک انتخاب شده و در محیط LB حاوی آنتی بیوتیک مناسب کشت داده شد. برای استخراج ناقل هایی با تعداد کپی بالا ۵ml از محیط LB کافی است اما برای ناقل هایی با تعداد کپی پایین باید از ml10 محیط LB برای کشت باکتری استفاده شود.
برای ناقل هایی با تعداد کپی پایین بهتر است ?l700 از محلول NB Buffer استفاده شود.
قبل از استفاده از SI به ازای هر ?l50 از آن ?l 1از RNase A به آن اضافه شد. این محلول پس از افزودن RNase A به مدت ۶ ماه در دمای C?4 قابل استفاده است.
پیش از مصرف Wash Solution اتانول ۱۰۰-۹۶% با نسبت خاصی به آن اضافه شد.
۲۰ml…………………………. Wash solution
۸۰ ml…………………………. Ethanol 90-100%
۱۰۰ ml…………………………. Total volume
قبل از مصرف SII و Buffer NB نباید رسوبی در آنها دیده شود. در صورت مشاهده رسوب، آن را در دمای C?37 قرار داده تا رسوب حل شود و سپس دمای آن را به C?25 برمی گردانیم.
۲-۱۱-۲-۱- روش انجام استخراج ناقل با استفاده از کیت شرکت بیوبیسیک
۱) محیط LB حاوی باکتری به یک ویال انتقال داده شد و در دور rpm12000و در دمای محیط به مدت ۲ دقیقه سانتریفوژ شده و محلول رویی به طور کامل خارج شد.
۲) رسوب سلولی حاصل در ?l100 ازمحلول SI معلق شد و ۱ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد.
۳) ?l200 محلول SII به محلول مرحله قبل اضافه شد و سپس ویال به منظور مخلوط شدن و ایجاد یک محلول شفاف و غلیظ ۶-۴ بار سر و ته شد و ۱ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد.
در این مرحله از ورتکس نمودن محلول خودداری نموده، زیرا منجر به شکست ناقل می شود. به علاوه این محلول نباید بیش از ۵ دقیقه در محیط یا روی یخ بماند تا به این ترتیب از دناتوره شدن ناقل جلوگیری شود.
۴) ?l350 محلول Buffer NB به محلول مرحله قبل اضافه شد و بلافاصله محلول ها با ۶-۴ بار سر و ته کردن ویال مخلوط شدند.
۵) مخلوط حاصل از مرحله قبل به مدت ۵ دقیقه در دور rpm12000 سانتریفوژ شد.
۶) محلول رویی به ستون های موجود در کیت انتقال داده شد.
۷) ستون به مدت ۲ دقیقه در دور rpm10000 سانتریفوژ شد و محلول زیرین دور ریخته شد.
۸) ?l750 از محلول شستشو به ستون

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید