منابع تحقیق درباره انعطاف پذیری، اکسیداسیون، انفورماتیک، نفوذپذیری

LTPگیاه گندم نیز اثر مشابه مشاهده شده است اما مکانیسم عمل به طور دقیق مشخص نیست اگر چه به نظر میرسد که این عمل به میزان دسترسی به حفره هیدروفوب LTPها بستگی دارد(Nieuwland et al. 2005).
۱-۵-۳- نقش LTPها در دفاع مقابل عوامل ضد میکروبی
LTP ها از اجزاء مهم دفاع مستقیم در مقابل آلودگی های باکتریایی و قارچ می باشند و اولین شواهد مربوط به این نقش LTPها بررسی های آزمایشگاهی روی عصاره پروتئین تربچه(Raphanus sativus)(Terras et al .1992)،جو(Hordeum vulgrare)(Molina et al.1993)،آرابیدوپسیس تالیانا (Segura et al .1993)،اسفناج(Spinacia oleracea)(Segura et al. 1993)و پیاز(Allium cepa) (Commue et al. 1995 ) به دست آمده است. هر کدام از این ایزوفرم ها بسته به نوع ایزوفرم ونوع آلودگی،رشد بیماری زاهای باکتریایی و قارچی را با درجات مختلف مهار می کنند.
نوع خاصی از پپیتید های خانواده LTP به نامAce- Amp1 که از دانه های پیاز جدا شده اند، با وجود این که فعالیت انتقال لیپیدی بین غشایی واضحی ندارند، اما خاصیت ضد میکروبی موثر و ویژه ای از خود نشان می دهند (Cammue et al 1995). مکانیسم عملکرد در این فرآیند به صورت واضح مشخص نیست، اما به نظر میرسد که این عمل در ارتباط با توانایی این ایزوفرم LTPدر گسترش نفوذپذیری غشاء عوامل بیماری زا و نه سلول های میزبان باشد(Cammue et al .1995;Regente et al.2005).این پپیتید قادر به ممانعت از رشد ۱۲ قارچ، باکتری های گرم مثبت باسیوس مگاتریوم و سارسینالوت ها در غلظت کمتر از۱۰ میکرو گرم بر میلی لیتر است.بر خلاف فعالیت ضد میکروبی Ace-Amp1 هیچ فعالیت سمی در برابر سلول های پستانداران(فیبروبلاست ها)ندارد(Cammue et al.1995;Ge et al. 2003).LTP ها با شرکت در تشکیل لایه خارجی دیواره سلولی گیاهان همراه با ترکیبات مثل دیفنسین و تیونین مانع از آلودگی ویروسی و قارچی می شوند(Van Loon . Hartz et a1.2010; Van Strein et al. 1999 ;Yeats and Rose.2008 )LTP.های گیاهی توسط آمینو اسید هایی با بار مثبت خود به سطح غشا میکرو ارگانیسم متصل شده و به وسیله متوقف کردن یک مسیر کلیدی یا لیز باکتریایی از رشد سلول باکتری ممانعت می کنند و در صورت حمله عامل بیماری زا ،گیاه میزان زیادی nsLTP بیان می کنند(Han et al 2001;Lee et al 1998;Samuel et al 2002).
به نظر میرسد فعالیت ضد میکروبی LTPها، به میکرو ارگانیسم های مورد بررسی بستگی داشته باشد. مثلا LTPدر گیاه برنج دارای فعالیت ضد قارچی علیه Picularia oryzae می باشد(Wang et al.2004). در گیاهی مثل Narcissus tazatta فعالیت ضد ویروسی و ضد توموری دارد (Lascombe et al.2008).LTPها با غشا عامل بیماری زا بر همکنش داده و در اثر کاهش استحکام غشا باعث افزایش نفوذ پذیری آن شده و به این ترتیب سبب مرگ میکرو ارگانیسم بیگانه می شوند(kadder et al.1996).
۱-۶-کاربردهای LTP
۱-۶-۱-بررسی کاربرد LTP در سیستم تحویل دارویی ۷
با توجه به اهمیت سیستم های انتقال دارو، مطالعات وبررسی های بسیار زیادی در این زمینه صورت گرفته که حاصل آن پیشرفت های کنونی در این راستا می باشد .از آنجا که امکان تخریب داروها در شرایط مختلف محیطی وجود دارد جهت افزایش اثر بخشی آن ها، این دارو ها باید در برابر شرایط محیطی پایدار باشند .ملکول های خانواده ی LTP2به دلیل داشتن توانایی اتصال به برخی ترکیبات و انتقال آن ها از غشا گزینه مناسبی برای استفاده در سیستم تحویل دارو می باشند(Pato et al. 2001;Pellerin et al.1999). nsLTPs با تمایل زیادی به دارو ها متصل می شوند و با نگه داری آن ها در فضای بسته ی خود از طرفی اثر سمی دارو ها را بر سلول های غیر هدف کاهش می دهند، و از طرف دیگر با ساختار پایدار خود از اکسیداسیون و تخریب دارو ها جلو گیری می کنند.در شکل ۸.۱ برهمکنش ترکیبات مختلف و انواع LTP نشان داده شده است .از آنجایی که nsLTPs مقاومت بالایی در مقابل دناتوراسیون ، دما و پروتئاز ها از خود نشان می دهند تمایل زیادی برای به کارگیری آن ها در سیستم های دارو رسانی وجود دارد (Chen and Janes et al .2004).دارو هایی که به nsLTP2گیاه برنج متصل میشوند را می توان در دو گروه جای داد:گروه اول ملکول های شبه استرول و گروه دوم مشتقات تری فنیل متان.
در مطالعات ساختاری سه بعدی nsLTP2 دو حفره ی هیدروفوب داخلی مشخص شده است که جایگاه اتصال به لیپید است. این ملکول به دلیل داشتن حفره ی هیدرو فوب انعطاف پذیر خود می تواند به ملکول های سختی مثل استرول ها هم متصل شود. nsLTP2در قسمت بالای حفره هیدروفوب خود یک کلاهک انعطاف پذیر دارند که سبب تسهیل اتصال ترکیبات هیدروفوب به آن ها می گردد(Elmorjani et al.2004).همچنین قرار گیری برخی اسید آمینه ها در جایگاه اتصالی ملکول های LTP اتصال به لیگاند را تسهیل میکند ،مثلا اسید آمینه Arg44در nsLTP2 گیاه برنج محل مناسبی را جهت برقراری بر همکنش الکترو استاتیک با لیگاند فراهم می کند.مطالعات نشان داده است که چربی های سطح پوست مثل اسفنگوزین و مشتقات آن و ترکیباتی مثل اتر فسفولیپید ها و مشتقات آزول BD56 که تاثیر ضد توموری و ضد لشمانیوزی دارد میتوانند با تمایل به LTP1 گیاه ذرت متصل شوند،اما آمفوتریپسین-B که داروی بسیار موثر ضد لشمانیوزی است به علت انعطاف پذیری کم و حجیم بودن در داخل حفره آبگریز LTP1ذرت قرار نگرفته و به این ترتیب قابلیت اتصال کمی به این پروتئین دارد(Pato et al .2004).
شکل۱.۸:برهمکنش ترکیبات مختلف از جمله کلسترول وانواع LTP ،برهمکنش nsLTP1 با ترکیبات A وBو برهمکنش nsLTP2 با ترکیبات C وD نشان داده شده است(Cheng et al.2004).
۱-۶-۲ -کاربرد LTP در حسگر های زیستی
از دیگر کاربرد های LTPها کاربرد آن ها به عنوان حسگر های زیستی است این حسگر ها اتصال به لیگاند های خاص را بر اساس وقایع اتصال، به سیگنالی قابل تشخیص و قابل اندازه گیری شناسایی میکنند.
در مطالعه ی انجام شده توسط Choiو همکاران در سال ۲۰۰۷ از LTPگیاه ذرت (mLTP) در حسگر های زیستی استفاده نمودند . قبل از استفاده از LTP در این حسگر ها آن را به یک ماده فلوروفور به نام آکریلودون متصل کردند، آکریلودون یک پروب فلورسانت حساس است که به یکی از سیستئین های تشکیل دهنده ی پیونددی سولفید در LTPمتصل می شود. اتصال لیگاند به mLTP منجر به تغییر کنفورماسیون آن از حالت منعطف به حالت سخت شده و کاهش محسوسی در نشر فلور سانس مشاهده می شود.این تغییر در نشر فلورسانس بیانگر اتصال دارو به LTP میباشد(Choi et al.2007).
۱-۷- هدف تحقیق
ایجاد جهش های نقطه ای در ژن nsLTP2گیاه برنج ایرانی (Oryza sativa)با هدف کاهش خاصیت آلرژی زایی آن به دنبال حذف بخش هایی آلرژن در جهت افزایش کارایی در سیستم های تحویل دارو
همسانه سازی ژن جهش یافته ی Rice-nsLTP2.
۱-۸- ضرورت انجام تحقیق
nsLTP ها به علت ویژگی های منحصر به فرد خود به ویژه توانایی اتصال به لیپید ها و برخی ترکیبات دارویی مثل دارو های ضد توموری و توانایی انتقال آن ها از غشا در شرایط in vitroگزینه مناسبی جهت استفاده در سیستم تحویل دارو می باشند.ضمن اینکه آلرژی زایی این پروتئین ها چالشی در استفاده از آن ها در مسیر درمان بالینی ایجاد میکند. بنا بر این ، با تلاش در جهت کاهش خاصیت آلرژی زایی، بیان و تولید انواع جهش یافته ی این پروتئین می توان پروتئین هایی با ساختار و عملکرد مناسب تر ایجاد کرد که در سیستم های دارو رسانی عملکرد بهتری داشته باشند.
فصل دوم
مواد و روش ها
در این فصل به معرفی تمام مواد و وسایل مورد نیاز، روش کار کیت ها و نحوه استفاده از آنها، تجهیزات و دستگاه ها و روش های ملکولی و بیوانفورماتیکی مورد استفاده در این پژوهش پرداخته شده است.
۲-۱- تجهیزات و دستگاه های مورد استفاده
دستگاه های مورد نیاز برای انجام این پژوهش در جدول ۲.۱ آورده شده است.
جدول ۲.۱.تجهیزات و دستگاه های مورد استفاده
نام دستگاه
مدل
نام شرکت سازنده
کشور سازنده
سانتریفیوژ
B011492
Labnet
آمریکا
pH متر
۱۱۰۲۰۲
BANTE

هود لامینار
BNF121
بهزاد نوین
ایران
یخچال -۲۰

Golsun
ایران
انکوباتور
SHF35
SHIMAZ
ایران
ورتکس- اسپین
Nd 005
Nedaye fan
ایران
منبع تغذیه
PSD1600

ایران
اسپکتروفوتومتر
۲۱۰۰
Unica
آمریکا
بن ماری
SHSWB15
SHIMAZ
ایران
تجهیزات الکتروفورز
۲۲۰۲۲۳۷
BIOMETRA
آلمان
اتوکلاو
۱۲۱A
ایران تولید
ایران
انکوباتور شیکردار
KM65
فن آزماگستر
ایران
۲-۲- مواد مصرفی و نحوه ساخت
مواد مورد نیاز برای انجام این پژوهش در جدول ۲.۲ ذکر شده است.
جدول۲.۲. فهرست مواد مورد استفاده
شرکت سازنده
نام ماده
Merck
Agar
Merck
Agarose
Merck
Acetic acid glacial
Sigma
Ampicilin
Thermo scientific
BpiI Enzyme
BIONEER
DNA gel extraction kit
GTP
DNA gel extraction kit
Thermo scientific
DNA Ladder 100bp
Merck
EDTA
Merck
Ethanol
Merck
Glucose
Merck
Glycerol
Merck
Glycine
Merck
Hydrochloric acid
Sigma
Kanamycin
Merck
۲- Mercaptoethanol
Merck
NaCL
Merck
Pepton
Bio Basic
Plasmid extraction kit
Merck
Peptone
Merck
Potassium acetate
Merck
SDS (Sodium dodecyl sulphate)
Thermo scientific
T4 DNA Ligase
Merck
Tris base
Thermo scientific
Xhol Enzyme
Merck
Xylon cyanol
Merck
Yeast extract
۲-۳- بخش آزمایشگاهی
۲-۴- سویه های باکتری استفاده شده( (Sorensen and Mortensen et al. 2005, Reece et al. 2004)
اشرشیا کلی TOP10 (پژوهشگاه ملی ژنتیک وفناوری)
اشرشیا کلی DH5? (پژوهشگاه ملی ژنتیک وفناوری )
اشرشیا کلی (DE3) BL21 )پژوهشگاه ملی ژنتیک وفناوری(
۲-۵- ناقل های استفاده شده
برای انجام ترانسفورماسیون ژن به داخل باکتری ابتدا باید آن را به یک ناقل مناسب متصل کرد و سپس ناقل نوترکیب را به داخل باکتری ترانسفورم کرد. سنتز ژن طراحی شده با هدف مورد نظر توسط شرکت ShineGene چین انجام گردید. طول قطعه سنتز شده bp 229می باشد. این ژن در وکتور pUC57 (شکل ۲.۲)کلون گردیده بود ، محصول فرستاده شده به صورت لیوفلایز بوده که به محض دریافت در ۱۰۰µl بافر TE محلول گردید . ناقلی که در این تحقیق جهت ترانسفورماسیون nsLTP2 جهش یافته در باکتری E.coli استفاده شده اند) pET26bشکل۲.۱ )می باشد.
۲-۶-طراحی وسنتز ژن nsLTP2 برنج ایرانی
درتحقیق حاضر توالی ژن nsLTP2 گیاه برنج ایرانی پس از تغییر نوکلئوتیدهای مورد نظر (جهت ایجاد جهش) وبررسی های لازم در جهت عدم تاثیرگذاری این جهش ها

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید