تعیین مقدار میزان آتروپین گیاه تراریخت و باززائی شده TLC به روش Datura metel L.

پژوهشی

مجــلــــــه دانشــــگاه عــلـــــوم پـزشــکـــــی مــازنــــــدران دوره بیست و یکم ویژه نامه 1 اسفند سال 1390 (202-196)

تعیین مقدار میزان آتروپین گیاه تراریخت و باززائی شده
TLC به روش Datura metel L.

طیبه همایی بروجنی1 علی اکبر احسانپور1 غلامرضا اصغری2

چکیده
سابقه و هدف: گیاه Datura metel L. غنی از آلکالوئیدهای مهم دارویی شامل هیوسیامین، اسکوپولامین و آتـروپی ن است. ضروری به نظر میرسد از فن آوری نوین جهت افزایش پتانسیل تولید متابولیت های ثانویه استفاده شود. چنـدین روشبرای نیل به این هدف وجود دارد. به عنوان مثال موتاسیون، القاء تنوعات سوماکلونال و انتقال T-DNA به گیاه.
مواد و روش ها: برای ارزیابی تنوعات سوماکلونال در گیاهان باززائی شده RAPD-PCRاستفاده شد.
یافته ها: در بین پرایمرهای استفاده شده پرایمرFPK2-19 بیشترین تنوع ژنتیکی را نشان داد. برگ و ریشه های لاین هـایتراریخت (شماره های 3،2،1) از نظر میزان آتروپین به روشTLC بررسی شدند. نتایج نشان داد که در لاین شماره 2 (T2) و T1 و گیاهان باززائی شدهR2 میزان کل آتروپین به 04/83، 01/61 و 79/77 درصد نسبت به گیـاه غیـر تراریخـت افـزایشنشان داد . به هر حال در لاینT3 میزان کل آتروپین 4/9 درصد نسبت به گیاه شاهد کاهش نشان داد. میزان آتروپین نوساقه و برگ در لاین T2 97/164 درصد نسبت به گیاه غیر تراریخت افزایش داشت.
استنتاج: میتوان نتیجه گیری نمود که میزان آتروپین در نوساقه نسبت به ریشه بیشتر بود و این نتیجـه ممکـن اسـت بـهواسطه تولید اتروپین ها در ریشه و سپس انتقال آن به نوساقه و برگ باشد. تنوعات سوماکلونال در انتقـالT-DNA بـه گیـاه در بیان ژن یا ژن های تولیدکننده آتروپین اثر بگذارد.

واژه های کلیدی: داتورا متل، تراریخت، آتروپین، RAPD PCR

مقدمه
جنس داتـورا یکـی از مهـمتـرین جـنسهـای تیـره آلکالوئیدهای تمام گونههای آتـروپین، اسـکوپولامین وسولاناسه میباشد که در نواحی گرم و معتدل کره زمین هیوسین را تشکیل می دهد(1). از آن جایی که ایـن ترکیبـات
دارای اثرات آنتی موسکارینی هستند، در درمان اخـتلالات عصبی و ناراحتی های قلبی کاربرد زیادی دارند. با توجهبه اهمیت دارویی و اقتصادی این گیاه، تکثیر آزمایـشگاهی آن با اسـتفاده از فنـون کـشت بافـت مـی توانـد بـه عنـوانجایگـزینی برای روش های ازدیاد سنتـی در نظـر گرفتـه پراکنده است . بوتهای یکساله است و ارتفـاع آن از 30 ســانتی متــر تــا 2 متــر مــی رســد. میــزان آلکالوئیــدها در قسمتهای مختلف گیاه و نیز در گونههای مختلف ایـنجنس اخـتلاف زیـادی دارد. ولـی نـوع آلکالوئیـدها درگونههای مختلـف تقریبـاً مـشابه بـوده و بیـشترین مقـدار

مولف مسئول: علی اکبر احسانپور- اصفهان: دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی E-mail: ehsanpou@yahoo.com
1. گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان
2. دانشکده علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان
) تاریخ دریافت : 28/10/89 تاریخ ارجاع جهت اصلاحات : 10/5/90 تاریخ تصویب : 3/11/90
علوم پزشکی

می شود(2). سلول های سوماتیکی گیاهـان بـاززایی شـده حاصل از کـشت بافـت، گـاهی تغییـرات ژنتیکـی نـشانمی دهند. این تغییـرات ژنتیکـی منحـصر بـه فـردی را دراختیار اصلاحکننده گیـاه بـرای اسـتفاده در برنامـه هـایاصــلاحی قــرار مــی دهــد. از آن جــایی کــه تغییــرات در سلول هایی که دارای منشا سوماتیکی (بدنی) هـستند رخ می دهد. ایـن تغییـرات تحـت نـام تغییـرات سـوماکلونالشناخته می شوند(3). تعیین این نوع از تنوعات ژنتیکـی ازطریق روش های مولکـولی، چـشم انـداز نـوینی را بـرایبررسی تنوع زیستی فراهم آورده اسـت(5). نـشانگرهایی که برای شناسائی این تغییرات استفاده می شـوند عبارتنـداز RFLP, AFLP, SSR و RAPD. در بـین نـشانگرهایمختلـف مولکـولی از نـشانگرهای RAPD بـرای تعی ین سطح تنوع ژنتیکی به کار می رود.
مهندسی ژنتیک مـیتوانـد وسـیلهای مناسـب بـرایافزایش آلکالوئیدها بهوسیله روشهایی همچـون بلـوککردن مسیرهای رقابتی، کاهش کاتابولیـسم محـصولاتو غلبه بر مراحل محدودکننـده سـرعت باشـد(6). امکـانانتقال T-DNA توسط Agrobacterium. tumefaciens حامل ژنهای مارکر همچون ژنGUS و ژن مقاومت به
کانامیسین (NPTII) بهمنظور القای تغییر در ژنوم و بررسـی امکان تولید آلکالوئیدهـای تروپـان در گیاهـان دارویـیوجـود دارد. در چنـین مــواردی آثـار حاصــل از ادغـام T-DNA در ژنوم وابسته به محل و تعداد نـسخههـایی ازژن است که در ژنوم گیاه ادغام میشود. به هر حـال ادغـام T-DNA با توجه به نوع و شدت اثری که بر ژنوم ایجـادمیکند، میتواند با اثر بر مسیرهای تولیـد متابولیـت هـایثانویه گاهی نوع و مقدار آن ها را تغییر دهد(11،10).
با توجه به ناکافی بودن اطلاعات منتشر شده در زمینـه روشهای تغییر مسیر متابولیسمی تولید آلکالوئیدها در این گیاه، هدف اساسی این پژوهش باززایی گیاه و بررسی تغییـرات سوماکلونال احتمالی در گیاهان باززایی شده و نیـز بررسـی تغییرات میزان آتروپین تولید شده در گیاه داتورا و بررسـیارتباط بین تغییرات سوماکلونال و تولید این ماده می باشد.
مواد و روش ها
در پژوهشهای قبلی محـیط کـشت مناسـب جهـت
بـاززایی Datura metel L. بـا اسـتفاده از محـیط کـشتmurashig and Skoog, 1962) MS) (7) در غلظــت mg/L BAP1 بهینـه شـد. در ایـن پـژوهش ابتـدا جهـت بررسـی وقـوع تنـوع سـوماکلونال بـین گیاهـان شـاهد و لاین هـای بـاززایی شـده داتـورا، چهـار لایـن از گیاهـانباززایی شده را به همراه گیـاه شـاهد انتخـاب کـرده و ازبرگ آنها با استفاده ازCTAB از بـرگDNA اسـتخراج شد(10). سپس با به کارگیری شش نـوع پرایمـرRAPD (جدول شماره 1) نسبت به بررسی تغییرات ژنتیکـی بـینگیاهان شاهد و باززایی شده اقدام شد. واکنشPCR درحجم 20 میکرومتـر شـامل 3 میکرولیتـرDNA ژنـومی، 2 میکـرولیتـــر بــافر PCR . 8/0 میکـرولیتــــر 2 MgCl،
2 میکــرولیتــر dNTP، 2/0 میکـرولیتـر Taq Enzyme،
5/1 میکرولیتر Primerانجام پذیرفت.

جدول شماره 1: پرایمرهای به کار رفته درPCR بـرای تـعیین تنـوعسوماکلونال. توال ی

RAPD PRIMER Sequense
OPAA 0-3 5′- TTA GCG CCC C -3′
FPK1-05 5′- ACT TGG CGG CCT -3′
OPAA-20 5′- TTG CCT TCG G -3′
OPAA-14 5′- AAC GGG CCA A -3′ OPB-08 5′-GTC CAC ACG G -3′
FPK2-19 5′-GGA CGG CGT T -3′

شـرایط PCR شـامل 94درجـه بـه مـدت 2 دقیقـه،
94 درجه به مدت 15 ثانیه، 35 درجه به مـدت 30 ثانیـه،
72 درجه به مدت 30 ثانیه، 72 درجه به مدت 5 دقیقه در
40 سـیکل بـود. محـصول واکـنش بـر روی ژل آگـارز
1 درصـد الکتروفــورز شــد و بــا رنـ ـگآمیــزی اتیــدیوم برومایــــد (mg/ml 10) در حــــضور تــــابشUV از ژل عکس برداری گردید.
جهـت تعیـین مقـدار آلکالوئیـد آتـروپین هـا ابتـدا گیاهان شاهد، باززایی شده و تراریخـت رشـد یافتـه درشـرایط کـشت در شیـشه بـه دو قـسمت انـدام هـوایی وریشه تفکیک و به طور جداگانه توزین شدند و در آونبا دمای °C70 به مدت 48 ساعت خشک گردید. سپس اجزای گیاه توسط آسـیاب بـه صـورت پـودر درآمدنـد .
بعد یک گرم از پودر بهدقت تـوزین شـد 10 میلـیلیتـرکلروفــرم و 25/0 میلــی لیتــر محلــول آمونیــاک غلــیظ (25 درصد) به آن اضـافه شـد و بـه مـدت 30 دقیقـه بـرروی شیکر با دورrpm 65 و در دمای آزمایـشگاه قـرارگرفت. سپس عصاره مورد نظر بـا کاغـذ صـافی صـافشد و به عصاره صـاف شـده 10 میلـیلیتـر آب مقطـر و5/0 میلی لیتر اسـید سـولفوریک 98-95 درصـد افـزودهشد. پـس از چنـد بـار تکـان دادن، فـاز کلروفرمـی دورریختــه شــد و بــه فــاز آبکــی در حــدود 10 میلــی لیتــر کلروفــرم دیگــر بــه همــراه 75/0 میلــی لیتــر آمونیــاک 25 درصد افزوده شد . پس از چند بـار تکـان دادن و دوفازی شدن عصاره، اینبار فاز آبکـی دور ریختـه شـد وفاز کلروفرمی زیرین در بن ماری قرار گرفـت تـا تغلـیظشود و به حجم 1 میلیلیتر کاهش یابد. عـصاره حاصـلجهــت بــارگیری بــر روی کاغــذTLC تجــاری مــورد استفاده قرار گرفت(9). لکهها با استفاده از محلـولهـایاســتاندارد آتــروپین و معــرف دراژنــدروف و نیتریــتسـدیم بـر روی کاغـذ TLC شناسـایی و بـا اسـتفاده از نـ رمافـزار Image j دانـسیته نـسبی نمونـه هـا محاسـبه و منحنی استاندارد غلظت/ دانسیته، از نمونههای استانداردترسیم شد . آزمایشات تعیین مقـدار آلکالوئیـد در طـرحبلوکهای کامل تصادفی در 3 تکرار انجام شد و آنالیزواریانس داده ها با استفاده از نرم افـزارSigma Stat 2.0 انجام شد . مقایسه میانگین بر اساس آزمون توکی انجـامگردید و سطوح معنی دار بودن در سطح 05/0p< محاسـبه شد و نمودار آن ها رسم گردید. یافته ها جهت بررسی وجود شباهت یا اختلاف ژنتیکی بـینگیاهان شـاهد و بـاززایی شـده داتـورا و بـا اسـتفاده از 6 پرایمر مختلف عملRAPD-PCR انجام شده و الگـویبانـدهای حاصـل از تکثیـر قطعـات DNA در لایـن هـای 1، 2، 3، و 4 بر روی ژل آگارز مورد مقایسه قـرار گرفتنـد. بهکارگیری شش نوع پرایمرRAPD (جـدول شـماره 1) و مقایسه محصولات آنها بر روی ژل آگارز نشان داد کـه پرایمرFPK2-19 بهخوبی میتواند گویـای وقـوع تنـوعژنتیکی سوماکلونال در بـین گیاهـان شـاهد و لایـنهـایباززایی شده داتورا باشد. وجود بانـدbp 1100 در لایـنشماره 2 و عدم آن در گیاهان شـاهد و سـایر لایـنهـایباززایی شده میتواند بیانگر رخداد نوعی تنـوع ژنتیکـیسوماکلونال در بین گیاهان بـاززایی شـده باشـد (تـصویر شماره 1). همچنین وجود باند bp520 در لاین 4 و عدم آن در گیاهان شاهد و نیز لایـنهـای 1، 2 و 3 مـیتوانـدتأیید دیگری بر وقوع نـوعی تنـوع ژنتیکـی سـوماکلونالدر گیاهــان لایــن شــماره 2 و 4 باشــد. از بــین گیاهــانبـاززایی شـده لایـن هـای 2 (R2) و4 (R4) بـا توجـه بـه اختلاف ژنتیکی نسبت به شـاهد بـرای آنالیزهـای میـزانآلکالوئید مورد استفاده قرار گرفتند. تصویر شماره 1: الگوی باندهای حاصل از تکثیر قطعات DNA با استفاده از پرایمر C .FPK2-19: کنترل منفی، SH: گیاه شاهد و 1، 2، 3 , 4: لاین های باززایی شده با توجه به اینکه حدود غلظت آتـروپین و هیوسـینگزارش شده در نمونههای گیاهی 500 تـا 2500 (ppm) گزارش شده است مقدار 5 غلظـت متفـاوت از آتـروپیناستاندارد تهیه گردید و از هر یک از نمونههـای اسـتاندارد و نیز عصاره اندامهای هوایی و ریشه نمونـههـای گیـاهی(شاهد، بـاززایی شـده و تراریخـت)، حجـم یکـسانی بـرروی پلیت کاشته و پس از اتمام جداسـازی از لکـههـایحاصل از کروماتوگرافی استاندارد (نمـودار شـماره 2) و اندام هوایی و ریشه عکسبرداری شد (نمودار شماره 3). تــصویر شــماره 2: کرومـاتوگرافی لایـه نـازک (TLC) غلظـت هـای مختلف استاندارد. 1: آتروپین با غلظتppm 5/312، 2 آتـروپین بـاغلظــت غلظــت ppm 625، 3 آتــروپین بــا غلظــت ppm 1250، 4 آتروپین با غلظت ppm 2500 و 5 آتروپین با غلظت ppm 5000 تصویر شماره 3: پس از تهیه عکس از لکههای حاصل، دانسیته نسبیهمۀ نمونه هـا (اسـتاندارد وگیـاهی بـا نـرم افـزارImage j محاسبه و منحنی تغییـرات غلظـت نمونـههـای اسـتانداردآتروپین، بر اساس تغییرات دانسیته نـسبی1 آنهـا ترسـیم گردید. با توجه به منحنی استاندارد حاصل مقادیر غلظت آتروپین در اندامهای هوایی و ریـشه نمونـههـای شـاهد،باززایی شده و تراریخـت محاسـبه شـد. آنـالیز واریـانس آماری دادهها نشان داد که اختلاف معنیدار بین سـطوحآتروپین در انـدام هـوایی گیاهـان مـورد بررسـی وجـوددارد. گیاهان لایـنهـای 1 (T ) و 2 (T2) تراریخـت بـهترتیــب 52/91 و 97/164 در صــد، افــزایش معنـ ـیدار و چشمگیر آلکالوئید را نسبت به شاهد نشان دادند و لایـن 3 تراریخت (T3)، 02/29 درصد کاهش معنی دار نـسبتبه شاهد نشان داد. گیاهان باززایی شده لاین 2 (R2) نیـز62/134 درصد افزایش معنی دار آلکالوئید را نـسبت بـهشاهد نشان دادند. در بین گیاهان تحت بررسـی، لایـن 2 (T2) و 3 (T3) تراریخت به ترتیب بـا 97/264 و 98/70 درصد آتروپین بیشترین و کمتـرین مقـدار آلکالوئیـد رادر اندام هوایی نشان دادند (تصویر شـماره 4). در رابطـهبا ریشه، لاین 2 تراریخت (T2) بـا مقـدار 25/94 درصـدکـاهش معنـی دار آلکالوئیـد نـسبت بـه شـاهد، کمتـرین غلظت آتروپین را در بین گیاهان نشان داد. در حـالیکـهآتروپین در اندامهای هوایی این لاین بیشترین غلظـت رانسبت به سایرین نشان داد. همچنین گیاهان باززایی شـدهلایـن 2 (R2) و لایـن 1 تراریخـت (T1) نیـز بـه ترتیـب 21/45 و 03/5 درصدی نسبت به شاهد نـشان دادنـد کـهکاهش معنیداری نبود . مقدار غلظت آتروپین در لاین 3 تراریخت (T3) با مقدار 03/33 درصد نـسبت بـه شـاهد،بیشترین مقدار را در بین ریشههای گیاهان تحت بررسـیداشت. این افزایش از نظر آماری معنیدار نبـود. ایـن درحالی بود کـه آتـروپین در انـدامهـای هـوایی ایـن لایـن کمترین غلظت را نسبت بـه سـایرین نـشان داده بـود. در مجمـوع رونـد تغییـرات غلظـت آتـروپین در ریـشه هـا و اندامهای هوایی کاملاً بر عکـس یکـدیگر بـود کـه ایـنمیتواند انتقـال احتمـالی آلکالوئیـد از ریـشه بـه سـاقه راتأیید کند (تصویر شماره 5 و 4). محاسبه نسبت آتروپین اندام هـوایی بـه ریـشه بـرایهر یک از گیاهان مورد بررسی نشان داد که ایـن نـسبتدر بین همه گیاهان مورد بررسی مثبت می باشد. به عبارت دیگر در همه گیاهان مقدار آتروپین اندام هوایی بیشتر ازریشه است . این نسبت در مورد گیاهان لاین 2 تراریخت(T2) بیــشترین و در گیاهــان لایــن 3 تراریخــت (T3) کمترین مقدار را نشان داد (نمـودار شـماره6). یـادآوریمیگردد که نتایج نمودار شماره 1 نشان می دهد که لاین 2 نسبت به بقیه لاینها دارای تغییرات سوماکلونال است. شکل شماره 4: غلظت آتـروپین در انـدام هـوایی گیاهـان تراریخـت(SH .(T1, T2,T3 : شاهد R2 : (گیاهان باززایی شده). حروف غیـرمشترک بیانگر معنیدار بودن دادهها (05/0P) بر اساس تست. 6000 4000 2000 ab ab a bc c 0 SH R2 T1 T2 T3 نوع گياه نمــودار شــماره 5: غلظــت آتــروپین در ریــشه گیاهــان تراریخــت ( SH .(T1, T2,T3: شاهد R2 : (گیاهان باززایی شده). حروف غیـرمشترک بیانگر معنی دار بودن دادهها (05/0P) بر اساس تست. نمـودار شـماره 6: نـسبت آتـروپین انـدام هـوائی بـه ریـشه گیاهـانتراریخت (SH .(T1, T2,T3 : شاهد R2 : (گیاهان باززایی شده). بحث از بــین پرایمــ رهــای RAPD، پرایمــر FPK2-19 بهخوبی توانست وقوع تنوع ژنتیکی سوماکلونال در بـینگیاهان شاهد و لاینهـای بـاززایی شـده داتـورا را نـشاندهد. از 4 لایـن مـورد بررسـی وجـود بانـدkb 1100 در لاین شماره 2 باززایی شده داتورا و عـدم آن در گیاهـانشاهد و سایر لایـنهـای بـاززایی شـده مـیتوانـد بیـانگررخداد نوعی تنوع ژنتیکـی سـوماکلونال در بـین گیاهـانمورد بررسی باشد (نمودار شماره 1). همچنین وجود باندbp 520 در لایـن 4 و عـدم آن در گیاهـان شـاهد و نیـزلاین های1، 2 و 3 می تواند احتمالاً تأیید دیگری بر وقوع نوعی تنوع ژنتیکـی سـوماکلونال در بـین گیاهـان مـوردبررسی باشد . در رابطه بـا وجـود اخـتلاف معنـیدار بـینسطوح آلکالوئیـد گیاهـان بـاززایی شـده (R2) و شـاهدمـی تـوان بـه ایـن مـسأله اشـاره کـرد کـه احتمـالاً وقـوعتغییـرات ژنتیکـی در گیاهـان بـاززایی شـده بـا تـأثیر بـر ژنهای مسیر بیوسنتز آلکالوئید میزان تولید آلکالوئیـد راتغییر داده است. به اینصورت که وجود باند اضـافیbp 1100 در لایــن 2 (R2) و عــدم آن در گیاهــان شــاهد احتمالاً باعث 62/134 درصد افزایش معنی دار آتـروپیندر اندام هوایی این لاین نسبت به شاهد شده است. بدیهی است که ایجاد تغییرات در سطوح آلکالوئیدگیاهان باززایی شده بهویژه افزایش بهدست آمده در اینپژوهش (در مورد لاینR2 ) بهدلیـل اهمیـت فـوقالعـاده آلکالوئیدهای تروپان بسیار مطلوب بوده و اعمـال تغییراتـی از این دست و تکثیر گیاهان حاصله میتواند موفقیتی درجهت بهبود هرچه بیشتر محصولات ثانویه ارزشمند دارویی و تجاری گیاهـان باشـد. از طـرف دیگـر کـاهش میـزانآلکالوئیدها در گیاهان باززایی شده ایـن زمینـه را ایجـادمــی کنــد کــه بتــوان از ایــن روش نــسبت بــه کــاهشآلکالوئیدهای نامطلوب ماننـد نیکـوتین در گیـاه تنبـاکواقدام نمود . دلیل چنین یافتههایی کاهش چشمگیر میـزانالکالوئید در لایـن 4 از گیاهـان تراریخـت مـیباشـد . در رابطـه بـا علـت وجـود اخـتلاف معنـی دار بـین سـطوح آلکالوئید اندام هوایی گیاهان شاهد و تراریخت نیـز ایـن طــور اســتنباط مـ ـیشــود کــه ترانــسفورماسیون و انتقــال T-DNA بــه ســلول هــای گیــاهی بــا تــأثیر مــستقیم یــاغیرمستقیم بر ژنهای بیوسنتزکننده آتـروپین و در نتیجـهبیان آنزیمهای بیوسنتزکننده آلکالوئیـد بـر میـزان تولیـداین محصولات اثرگذاشته است . نوع، شدت و میزان اینتأثیر به عوامل مختلفی وابسته اسـت کـه از جملـه آنهـامـی تـوان بـه تعـداد نـسخهT-DNA ادغـام شـده درون ژنوم سلولهای گیـاهی و بـه محـل ادغـام ایـن نـسخههـااشاره کرد . در حال حاضر در حد یـک فـرض مـیتـوانگفت احتمالاً انتقالT-DNA به ژنوم گیاه داتورا متـل ازطریق فعالسـازی مـسیر رونویـسی ژنهـای مـسیر بیوسـنتزآلکالوئید و یا بالعکس و خاموش نمـودن ایـن مـسیر عمـلنمــوده اســت. بــه هــر حــال اظهــار نظــر قطعــی در ایــن خصوص نیاز به مطالعه دقیـقتـر دارد. در بررسـی میـزانالکالوئید در گیاهان معمـولاً از روشهـای حـساس تـرینظیرHPLC استفاده میشـود ایـن روش نیـاز بـه مـواد ودستگاه کارا و هزینه بالاتری لازم داشـته و بهینـه سـازیشرایط آن گاهی چندین مـاه وقـت لازم دارد. در حـالیکه روشTLC ممکن است حـساسیت و دقـت آن کمتـرباشد ولـی حـداقل در مـورد بررسـی میـزان الکالوئیـد درمنابع گیاهی در زمان کوتاه تـر و هزینـه کمتـر جـایگزینخوبی می باشد(4). در مجمــوع رونــد تغییــرات غلظــت آتــروپین درریشهها و اندامهای هوایی کاملاً برعکس یکـدیگر بـود. در رابطــه بــا ریــشه، لایــن هــای T1 ،R2 و T3 تغییــرات معنیدار نسبت به شاهد نـشان ندادنـد. تنهـا لایـنT2 ، بـامقدار 25/94 درصد کـاهش معنـی دار آلکالوئیـد نـسبتبه شاهد، کمترین غلظت آتروپین را در بین گیاهان موردنظـر نـشان داد (نمـودار شـماره4). ایـن در حالیـست کـه آتروپین در اندامهای هوایی این لاین به شـدت افـزایشیافته به طوریکه بیشترین غلظت را نسبت به سایرین نشانداد (تصویر شماره 4). این نکته بیانگر ایـن اسـت کـه بـهاحتمال زیاد درT2 ، قدرت سـنتز آلکالوئیـد در ریـشه وانتقال آن به ساقه نسبت به شاهد بسیار زیـاد شـده اسـت. علاوه بر آن بین سطوح آلکالوئید ساقه و ریـشه در همـهگیاهان مورد بررسی اختلاف معنی دار وجـود دارد. ایـناختلاف از طریق محاسبه نسبت آتروپین اندام هـوایی بـهریشه برای هر یک از گیاهان مورد بررسی پیگیری شد . نتایج نشان داد که این نسبت در بین همـه گیاهـان مـوردبررسی مثبت (بیـشتر از 1) مـیباشـد (تـصویر شـماره5). بـه عبـارت دیگـر در همـه گیاهـان مـورد بررسـی مقـدار آتروپین سـاقه بیـشتر از ریـشه بـود. ایـن دو مـسأله یعنـیمعنیدار بودن اختلاف سطوح آلکالوئید انـدام هـوایی وریشه از یک طرف، و از طرف دیگر مثبت بـودن نـسبتسطوح آلکالوئید اندام هـوایی بـه ریـشه مـیتوانـد تأییـدکننده این موضوع باشـد کـه در تمـام گونـههـای مـوردبررسی آلکالوئید در ریشه ساخته شده و به انـدام هـواییمنتقل شده است. تحقیقات نـشان داده کـه بـاز هـای آزاداسکوپین و تـروپین کـه پـیشسـاز سـنتز آلکالوئیـد هـایتروپان هستند در ریشهها بیشتر وجود دارند. در حالی کـهدر بخشهای هوایی مقـادیر بـالای تجمـع آلکالوئیـدهـامشاهده میشود. این الگو احتمالاً منعکسکننده موقعیتفیزیولوژیکی اندامها در رابطه با سنتز و توزیع آلکالوئیـداست. معمولاً ریشهها محل بیوسنتز آلکالوئیدهای تروپانمیباشـد و آلکالوئیـدهـا بعـد از بیوسـنتز بـه بخـشهـایهوایی منتقل میشوند و ممکن است در آن جـا مـشتقاتدیگری نیز تولید کنند(12). در مجموع با توجه به وجود اطلاعات کـم پیرامـوناثـــرات ناشـــی از انتقـــالT-DNA حامـــل ژن GUS و NPTII، بـر روی میـزان آلکالوئیـ دهـای گیـاه مـی تـوان بــه عنــوان یــک پیــشنهاد اولیــه بــرای بیــان نحــوه تــأثیرترانسفورماسیون بر بیوسنتز آلکالوئیدها و ایجاد اخـتلافمعنی دار بـین سـطوح آلکالوئیـد در بـین گیاهـان مـوردبررسی به موارد ذیل اشاره کرد. - اخــتلاف در میــزان ســنتز آتــروپین و انتقــال بــهبخشهای هـوایی در بـین گیاهـان مـورد بررسـی وجـوددارد. زیرا عدم بیوسنتز و انتقال به بخشهای هوایی و نیزبیوسنتز اما عدم انتقال نیز میتواند تـا حـدی علـت بـروزاختلاف سطوح آلکالوئید را توجیه نماید. - اختلاف در مقدار و نسبت بخشهای اندام هوائییعنی برگ و ساقه برداشته شده برای آنـالیز وجـود دارد. چون این دو اندام ممکن است پتانسیل ذخیرهای متفاوتیبرای تجمع آلکالوئید داشته باشند(7). - بــه دلیــل وقــوع تغییــرات ســوماکلونال در بــین گیاهان. اخـتلاف در بیـان نـوع آنـزیم کلیـدی در مـسیربیوسنتز آلکالوئید وجود دارد. سپاسگزاری نویسندگان مقاله از تحصیلات تکمیلی دانـشگاه بـهواســطه حمایــت از ایــن پــژوهش تــشکر و قــدردانیمی نماید. scopolamine in hair by LC-MS-MS after Datura inoxia abuse. Journal of Analytical Toaxonomy 2006; 30: 454-457. .8 Zhang L, Kai GY, Lu BB, Zhang HM, Tang KX, Jiang JH, et al. Metabolic Enineering of Tropane Alkaloid Biosynthesis in Plants. Journal of Integrative Plant Biology 2005; 47: 136-143. .9 Abd El-Rahman R, Gabal A, Khlifa HD. Production of Scopolamine and Hyoscyamine in Calli and Regenerate Culture of Datura metel L. Journal of Applied Science Research 2008; 4: 1858-1866. .01 Zayed R, Wink M, El-Shamy H. In vitro organogenesis and alkaloid accumulation in Datura innoxia. Z Naturforsch 2006; 61(c): 560-564. .11 Ehsanpour AA, Twell D. Analysis of SFL1 and SFL2 Promoter Region in Arabidopsis thaliana using gateway cloning system. Journal of Science 2005; 16: 303-309. .21 Samuelsson G. Drugs of Natural origin. Swedish Pharmaceutical Press, Stockholm. 1992. pp. 318. References .1 Evan S, Willian C. 2002.Treas and Evans Pharmacognosy. London Harcourt Publisher 11, 4-8. 2. میــر حیــدر، ح . 1373. معــارف گیــاهی (کــاربرد گیاهــان درپیشگیری و درمان بیماریها). انتشارات تیمورزاده تهـران. جلـد 5. 448 صفحه. 3. نــوروزی، پیمــان .1382. بررســی تحمــل بــه شــوری و تنــوعکروموزومی در کشت سلول چقندرقند. مجله چغندر قند علمی-پژوهشی .جلد 19 شماره 1 ،.54-59 .4 Mandal S, Naqvi AA, Thakur RS. Simultaneous determination of atropine and scopolamine in plants by mixed-column high performance liquid chromatography. Phytochemical Analysis 2007; 2: 208-210. .5 Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 1962; 15: 473-497. .6 Szmidt AE. Measuring and monitoring biodiversity in tropical and temperateforests. Center for International Foresty Research 1994; 45: 177-193. .7 Pascal K, Marion V, Yann B, Jean-Yves C, Vincent C. Testing for atropine and

این نوشته در مقالات و پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.